研究生发表论文遗传标记在生物技术中的应用(2)
3.2以电泳技术和PCR技术为核心的分子标记
PCR技术问世不久,便以简便、快速和高效等特点迅速成为分子生物学研究的有力工具,尤其是在DNA分子标记技术的发展上更是发挥了巨大作用。根据所用引物的特点,这类分子标记可概括为3种类型:
3.2.1单引物PCR标记。是以一个寡核苷酸序列为引物,对基因组DNA进行PCR扩增来鉴别多态性DNA的过程。其代表性技术是RAPD。随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphism DNA,RAPD)是以寡核苷酸序列(通常为10个核苷酸)为引物,对基因组DNA随机扩增,从而得到多态性图谱作为遗传标记的方法。
3.2.23′端具有选择性的双引物PCR标记。该类最典型的技术为扩增片段长度多态性(Amplified fragment length poly-morphisms,AFLP)。其基本原理是利用一个在基因组DNA中酶切位点少的内切酶和一个内切酶位点多的内切酶组合,对基因组DNA进行完全消化,再使用双链人工接头与酶切片段的粘性末端连接作为反应模板,先进行预扩增,之后再进行选择性PCR扩增,最后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳展现其多态性[7]。
3.2.3基于特异双引物的PCR标记。切割的扩增产物多态性序列(Cleaved amplified polymorphism sequence,CAPS)标记是指PCR产物经限制性内切酶消化后所表现出的DNA片段长度的变异,表现为共显性遗传。特异引物序列来自基因数据库、基因组或cDNA克隆以及已克隆的RAPD条带等。
3.3以DNA测序技术为核心的分子标记
随着人类基因组研究计划的深入和DNA自动测序技术的不断改进,以DNA序列为核心的分子标记也孕育而生,其中最具代表性的是表达序列标定标记(Expressed sequence tags,EST)。EST标记主要是在cDNA文库中随机挑选克隆,并进行单向测序(Single pass sequencing)生成的250～400 bp的核苷酸序列片段。由于ETS来源于cDNA克隆,因此部分反映了基因组的结构及不同组织中基因的表达模式[2]。
4遗传标记的应用
4.1遗传图谱的构建
一般步骤包括:选择用于作图的遗传标记;根据遗传材料的多态性确定作图群体的亲本和组合;培育具有大量遗传标记处于分离状态的群体或衍生系;作图群体中不同个体和品系标记基因型确定;标记之间的连锁群的构建。
4.1.1经典遗传图谱。经典遗传图谱构建理论基础是染色体的交换和重组。用重组率来揭示基因间的遗传图距,其单位用厘摩(centiMorgan,cM)表示,1个cM的大小大致符合1%的重组率[8]。
4.1.2分子遗传图谱。在高等植物中,RFLP最初用于已被经典遗传学比较详细研究的一些作物的遗传图谱的构建,如玉米和番茄[9-10]。对样品提取所得DNA采用多种限制性内切酶处理,对所有探针在亲本间的多态性进行检测。AFLP能够揭示大量的多态性位点,可以弥补传统的RFLP标记多态性低的缺点,特别是对于没有很多DNA序列的物种来说,利用其近源种的DNA序列(包括EST)而发展的其他分子标记结合AFLP标记,构建高密度的遗传连锁图是非常有效的一种策略[11]。
4.2基因定位
基因定位是遗传学和育种学研究中的重要内容,也是基因克隆的基础工作。目的基因的定位一般要经过初步定位和精细定位2个过程。目的基因的初步定位是利用分子标记技术在一个目标性状的分离群体中把目的基因定位在染色体的一个区域内。在初步定位的基础上,利用高密度的分子标记连锁图对目的基因区域进行区域高密度分子标记连锁分析,以便精细定位目的基因。
5小结
动物遗传标记是随着人类对基因由现象到本质的认识而由形态标记向分子标记逐步发展的过程,技术手段由复杂、高成本向简便、低成本转变。各个阶段的遗传标记方法,各有其优缺点和使用范围。随着分子生物学技术的深入和完善,遗传标记手段必将逐步改进,为遗传学研究和遗传育种起到巨大的推动作用。
6参考文献
[1] 贾继增.分子标记种质资源鉴定和分子标记育种[J].中国农业科学,1996,29(4):1-10.
[2] 王永飞,马三梅,刘翠平,等.遗传标记的发展和分子标记的检测技术[J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2001,29(6):130-136.
[3] 李柱刚,崔崇士,马荣才.遗传标记在植物上的发展与应用[J].东北农业大学学报,2001,32(4):313-319.
[4] 张培江,才宏伟,袁平荣,等.利用同工酶标记水稻亲本遗传差异及其在杂交水稻育种中的利用[J].杂交水稻,2002,17(2):47-52.
[5] 魏麟,黎晓英,黄英,等.遗传标记及其发展概述[J].动物育种,2004,21(10):42-45.
[6] 王关林,方宏筠.植物基因工程[M].2版.北京:科学出版社,2002.
[7] 李韬.AFLP标记技术的发展和完善[J].生物工程学报,2006,22(5):861-865.
[8] 刘杰,何德,李永红.林木遗传图谱构建的研究进展[J]生物技术通报,2008(1):38-41.
[9] 黄烈健,向道权,杨俊品,等.玉米RFLP连锁图谱构建及大斑病QTL定位[J].遗传学报,2002,29(12):1100-1104.
[10] WU X,LARSON S R,HU Z,et al.Molecular genetic linkage maps for allotetraploid Leymus wildryes(Gramineae:triticeae)[J].Genome,2003(46):627-646.
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