农业工程简述植物抗病基因工程(2)
已克隆的avr基因有50多个,多源于细菌,而真菌avr基因的克隆难度较大。超过40种细菌的无毒基因被克隆、测序,这些无毒基因主要来源于假单胞属Pseudomonas和黄单胞属Xanthomomas。目前无毒基因在植物抗病基因工程上的实际应用远比植物本身的抗病基因广,且有良好的应用前景,因此对病毒基因的克隆具有重要的意义。
2.3植物防卫反应基因
植物防卫反应基因是由抗病基因产物与无毒基因产物相互识别后激活的,对病原菌有直接作用的植物基因在植物的防御机制中起着重要作用。因此,导入植物防卫基因是目前抗病基因工程中较为有效的一种策略[17]。已分离的防卫基因有:参与植保素(PA)合成的相关酶基因、病程相关蛋白(PR)基因、木质素合成相关基因、钝化病原菌致病酶或毒素的蛋白质基因、富含羟脯氨酸糖蛋白和富含甘氨酸糖蛋白的基因、核糖体失活蛋白基因、溶菌酶基因等。
2.3.1病程相关蛋白(PR)基因。病程相关蛋白(PR)基因是目前的研究热点,该基因对植物的抗病性,尤其是系统获得性抗性具有重要作用。近年来陆续发现的PR蛋白有:几丁质酶CHI、β-l,3葡聚糖酶GLU、类甜蛋白等。其中,又以CHI和GLU的研究最多。几丁质酶CHI和β-l,3葡聚糖是大多数植物病原真菌细胞壁的主要成分,CHI和GLU具有降解病原真菌细胞壁的作用,纯化的几丁质酶和葡聚糖酶单独或同时存在都能抑制病原真菌的生长,从而抑制病原真菌的侵染。现已从菜豆、水稻、烟草、拟南芥、油菜和甜菜等中克隆到几丁质酶基因,从大豆、烟草、大麦和豌豆等作物中克隆到葡聚糖酶基因。由菜豆几丁质酶基因单独转化、烟草葡聚糖酶基因与菜豆几丁质酶基因联合转化得到的转基因植株分别对烟草立枯丝核菌和烟草赤星病有较高抗性[18]。一些葡聚糖酶基因也从大豆、大麦、烟草等作物中分离,与合适的启动子构建重组质粒后转化植物获得了转基因植物。Zhu等[19]报道水稻碱性几丁质酶基因和苜蓿葡聚糖酶基因的转基因烟草对烟草蛙眼病表现出了较只转一种基因的烟草更强的抗性。
2.3.2溶菌酶基因。溶菌酶具有几丁质酶和葡聚糖酶的双重活性,对植物病原菌表现出很强的裂解活性。在已获得的T4噬菌体溶菌酶基因的转基因马铃薯中,虽然只有低水平的合成表达,但能有效地分泌到由胞间隙中,明显提高了对马铃薯黑胫病的抗性。
2.4其他生物的抗菌蛋白基因
自然界中的各种生物对病原菌都有其自身的防御机制和相应的抗菌物质,这为人们寻找抗菌蛋白基因提供了一个广阔空间。目前,人们已从昆虫、动物、细菌、真菌中分离到许多抗菌蛋白,将其笼统称为“抗菌肽”。
抗菌肽主要是通过形成离子通道直接破坏细胞膜来杀灭病原菌,因此病菌很难对基产生抗性。加之抗菌肽具有抗菌谱广、分子量小、基因操作容易等特点,因此分离和克隆这些抗菌肽基因并将其转入植物中是当前抗真菌基因工程的一个主要研究内容,植物转抗菌肽基因工程的研究已成为植物抗病育种的重要途径。Yevtushenko等[20]曾将Cecropin基因导人烟草中,发现可降低烟草真菌病害引起的死亡率。
3转化方法
自1983年第一例转基因植物-烟草在美国获得成功以来[20],经过科学家20多年的探索,转基因技术日臻成熟,已形成了以农杆菌转化和基因枪转化技术为主体的两大植物转化系统。其中,农杆菌介导的基因转移占绝大多数,成功率最高。基因枪法也是主要的转化方法,其他的转化方法也都成功地得到了转基因植株,各具特点。
3.1农杆菌介导法
第一例转基因植物就是用农杆菌介导法完成的。农杆菌介导的基因转化方法是迄今最可靠、最有效的转化方法。
根癌农杆菌含有Ti 质粒,Ti 质粒上的T-DNA 可以插入到植物基因组中,诱导宿主植物中瘤状物的形成。因此,将外源目的基因插入到T-DNA 中,借助Ti 质粒的载体作用,使目的基因在宿主植物中整合、表达。
农杆菌介导法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导入的受体,通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触,以完成可遗传细胞的转化,然后利用组织培养的方法培育出转基因植株,并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代。农杆菌介导法又可根据其受体材料不同分为原生质体共培养法、叶盘法和创伤植物感染法,其中叶盘法在许多植物上得到广泛应用。
3.2基因枪法
该法又称粒子轰击,高速粒子喷射技术或基因枪轰击技术,是由美国康奈尔大学生物化学系John.C.Santord等于1983年研究成功,其基本原理是利用亚精胺、聚乙二醇的粘附作用将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面,然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织;并在1987年,Klein[21]首先报道了应用此技术将烟草花叶病毒RNA吸附到钨粒表面,轰击洋葱表皮细胞,经检测发现病毒RNA能进行复制,并以同样技术将氯霉素乙酰转移酶基因导入洋葱表皮细胞。基因枪法的操作对象可以是完整的细胞或组织,突破了基因转移的物种界限,也不必制备原生质体,实验步骤比较简单易行,具有相当广泛的应用范围。现在,该技术已在烟草、水稻、小麦、黑麦草、甘蔗、棉花、大豆、菜豆、洋葱、番木瓜、甜橙、葡萄等多种作物上试用成功。
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