编辑部征稿研制冻干小鼠的神经生长因子

　　关键词: 编辑部征稿,神经生长因子,小鼠,纯化,质量鉴定

　　摘 要:目的 研制小鼠神经生长因子(NGF). 方法 采用二次阳离子柱层析法，从雄性小鼠颌下腺分离提取2.5S神经生长因子，建立了稳定的实验室与中试生产工艺，以及相应的质量鉴定规程. 结果 从体质量超过25g，鼠龄大于60d的雄性小鼠体内可获得高纯度、高产量、高活性的2.5S NGF.纯度大于95%，与抗2.5S NGF抗体有特异结合能力，鸡胚背根神经节培养法测定的生物活性显示，其比活性达到5×108 BU・g-1 (BU:生物活性单位)以上，各项指标均符合质量鉴定标准.20g・L-1 人血白蛋白做冻干赋形剂，能有效保护NGF的生物活性. 结论 研制了高质量的冻干小鼠神经生长因子，为NGF的临床前和临床研究奠定了基础.

　　0 引言

　　神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是神经营养素家族中发现最早、研究最多的一种神经营养蛋白.其分子结构、理化性质、基因结构、主要生物学功能、受体的结构和性质等均己先后被阐明[1，2] .NGF可促进中枢及外周神经系统的发育和分化，维持神经系统的正常功能，加快神经系统损伤后修复.越来越多的研究[3-7] 表明，NGF与许多神经系统的病理改变有关，做为一种神经系统损伤后的治疗用药，NGF具有重要的开发和临床应用价值.我们探讨并建立了从成年雄性小鼠颌下腺分离纯化2.5S NGF的方法，并已完成中试放大工艺研究与相应的质量鉴定方法.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物及其来源 清洁级昆明种雄性小鼠，由本校实验动物中心提供，符合卫生部《医学清洁级实验动物质量标准》.

　　1.1.2 试剂 CM Sepharose Fast Flow层析介质、等电聚焦标准蛋白为Pharmacia公司产品;抗鼠2.5S NGF单克隆抗体、2.5S鼠NGF标准品及West-ern blot试剂盒为Promega公司产品;200g・L-1 人血清白蛋白、200g・L

　　-1 甘露醇及其他化学试剂均为国产分析纯试剂，符合《中国生物制品主要原材料试行标准》(1993年版)规定.

　　1.1.3 主要仪器设备 XHF-1型高速分散器为上海金达生化仪器厂产品;LKB GP-10型液相色谱仪为Pharmacia公司产品;LGS-111型冷冻干燥机为上海长江制冷公司产品.

　　1.2 方法

　　1.2.1 鼠2.5S NGF的分离制取 参考Mobley等[8] 的二次阳离子柱层析法从小鼠颌下腺中制取2.5S NGF.首先用CM I层析柱在pH近中性条件下吸附颌下腺匀浆上清中等电点大于6.8的杂蛋白并予以分离去除，收集穿过峰;然后在pH小于5的条件下使NGF解离为αNGF，βNGF以及γNGF亚基，利用βNGF与其他亚基等电点的差异，使用CM II层析柱吸附有生物活性的βNGF及其衍生物(共称为2.5S NGF组分)，分段洗脱，收集2.5S NGF组分.

　　1.2.2 紫外吸收光谱及蛋白含量测定 用PEλ14型可见/紫外分光光度计对样品进行扫描，波长范围为200～320nm;Lowry法测定蛋白含量.

　　1.2.3 纯度及分子质量测定 SDS-PAGE电泳加薄层凝胶扫描测定样品纯度，120g・L-1 PAGE凝胶垂直平板电泳，电极液为pH8.3甘氨酸-Tris缓冲液，上样量5μg，电压120V，电泳1.5h，硝酸银染色;根据各标准蛋白移动的相对距离在半对数纸上绘制标准曲线，由样品蛋白的相对移动距离从标准曲线上查出相应分子质量.

　　1.2.4 鉴别试验及等电点测定 采用免疫印迹法(Western blot)鉴定NGF与特意抗体的结合力.薄层聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦法测定样品的等电点，70g・L-1 聚丙烯酰胺凝胶，厚1mm，含pH3.5～10两性电解质，上样样品量20～30μL，电泳条件为:电压1500V，功率1W・cm-1 宽凝胶.

　　1.2.5 生物活性测定 鸡胚背根神经节培养法[9] 测定生物活性，取孵化7～10d的鸡胚背根神经节接种于涂布鼠胶原纤维的24孔培养板中，加入含不同浓度NGF的DMEM培养液，在无血清条件下37℃培养24～48h，倒置显微镜下进行相差观察，确定NGF提取物的生物活性，以突起生长最好的稀释度的倒数定为NGF生物活性单位(BU).

　　1.2.6 冻干 用生理盐水配制的60g・L-1 甘露醇或20g・L-1 白蛋白将检定合格的半成品稀释至5×106 BU・L-1 ，0.22μm滤膜过滤除菌.使用2mL西林瓶，每支分装0.5mL，内含2.5S NGF2500BU，冻干得成品，置4℃以下干燥处保存.

　　2 结果

　　2.1 鼠龄与体质量对最终产量的影响 鼠龄低于60d，体质量少于20g的未成年小鼠，不仅最终NGF的产量明显低于成年雄性小鼠，而且其生物活性也明显低于标准，相反，使用体质量超过30g的种公鼠颌下腺，2.5S NGF的终产量更高(Tab1)，制备量扩大至每次2000只成年雄鼠，获得了相似的结果.

　　2.2 紫外吸收光谱及蛋白质含量 2.5S NGF提取物呈典型的蛋白吸收曲线，最大吸收峰值为(280±1)nm;半成品蛋白含量大于0.15g・L-1 .

　　2.3 纯度及分子质量 在SDS-PAGE电泳中，纯化产物形成一条稍宽的带(Fig1)，凝胶扫描纯度大于 95%，Mr 为13500.

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